Abstract: Rubia tinctorum as Effective Phytoremediator of Soils Contaminated with Cadmium

The term phytoremediation evolves from the use of plants as cleaning agents for polluted soils.  Soils are contaminated with heavy metals added by the use and construction of explosives, pesticides or industrial chemicals.  Heavy metals like cadmium have an uneasy and slow natural removal from soils.  One of the objectives of this research project is to inquire about the cadmium resistance and accumulation capacity of Rubia tinctorum. Rubia is a diuretic, medicinal plant capable of complexing calcium ions, ions of similar ionic radii as Cd⁺² under hydrated conditions.

R. tinctorum has been cloned in vitro under growing conditions that stimulate root proliferation. Plantlets with roots and two to five eyes were recultured in growing media doped with Cd⁺² up to 50 ppm.  After two weeks, the medium was analyzed for free Cd⁺² using a cadmium selective electrode. Preliminary results show that Rubia clones used are both resistant to Cd⁺² and capable to accumulate it. Ion cadmium concentration decreased in the growing media as this is taken as preliminary evidence that the plant is capable to absorb Cd⁺² from the medium. We have also observed that the growing media changes in color to a variety of tonalities from red to orange depending of the initial Cd⁺². For future work, we need to confirm these preliminary results and observations and analyze the chemistry composition of the plant and the cadmium containing media.

Biominds Poster Day

El biominds poster day fue un día en el que se pudo apreciar todo lo logrado a través de los tres semestres de investigación. Al visitar otras presentaciones pude ampliar mi visión en tópicos como la neurología, genética y biología. El primer poster que visite lo fue el de O. Vázquez el cual se titulaba “Green Light for all Inbound Traffic: Human Breast Adenocarcinoma and Human Characterizing Colon Adenocarcinoma Cells’Membrane Trafficking of Superparamagnetic Nanoparticles”. A través de este poster comprendí más a fondo las aplicaciones de la nanotecnología en el área médica, especialmente en el tratamiento de células cancerosas. El problema básico lo era la estabilización de las nanopartículas y comprender de manera más profunda la reacción de estas en los patrones de mecanismos bioquímicas del organismo. La segunda presentación lo fue la de Andrea V. Rivera la cual titulaba “Understanding The Role of Phosphorilation in the Nonsense-Mediated mRNA Decay (NMD) Pathway”. En esta investigación se trabajó con un mecanismo específico que ocurre en el mRNA y es responsable de mutaciones causantes de enfermedades genéticas. Básicamente se trataba de identificar los componentes los cuales fosforilaban y permitían la transcripción. En este caso se reconoció la importancia de detectar y poder remediar enfermedades desde la región de fallo, los genes. Finalmente el último poster lo fue el de Roy Suárez el cual tenía como tema “The Mechanism of Ag₂S Nanocluster Formation”. En este trabajo se estudio el crecimiento de nanopartículas de Ag₂S, el cual bien puede estar ligado a interacciones magnéticas o electroestáticas. Además se tuvo en cuenta las características de este material ante espectros ultravioletas y la conductividad iónica que posee. Al final del día en el Biominds poster day me di cuenta de que este tiempo fue muy bien invertido y que la experiencia fue enriquecedora.

Progreso

Durante el proceso de investigacion; especialmente en el transcurso del tema de investigacion planteado dese el comienzo, se han superado ciertos obstaculos.  El primero lo es la contaminacion e las plantas y el medio.  Esto resulto ser el mayor causante de provocar experimentos fallidos.  Cambios en nuestra indumentaria para trabajar y en los metodos de subciltivo y limpieza lograron una conciderable reduccion en los casos de contaminacion en los “stocks”.  Otro de los problemas resueltos fue la poca disponibilidad para experimentacion de las plantas.  Para esta situacion se realizaron multiples subcultivaciones y se detuvo los experimentos hasta que el numero de plantas aumentara.  El equipo a utilizar durante la experimentacion fue calibrado y evaluado en cuanto a la sensibilidad de las medidas que reportaba, dando buenos resultados.  Al concluir la experiencia investigativa y el poder probar la hipotesis realizada inicialmente se puede decir que la el trabajo realizado complio con los objetivos realizados inicialmente.

Avances en la investigacion

A través del año de investigación en fitoremediación de suelos contaminados con metales hemos logrados las expectativas principales existentes. Se logro evaluar la capacidad de absorción de cadmio; nuestro metal a evaluar, se calibro y aprendió a utilizar correctamente instrumentación como el electrodo medidor de iones de Cd⁺² y, además de las siempre irremplazables técnicas asépticas se aprendió a evaluar adecuadamente la data obtenida.

La meta principal de evaluar la capacidad de absorbancia de cadmio en la planta baquiña sigue aun en pie, pues el experimento se desarrollo con la planta rubia. Esto fue debido a muchos factores como la poca disponibilidad de la baquiña y su estado prematuro para el experimento. Otra meta existente lo es la evaluación del medio en el cual se encuentra el espécimen interaccionando con el metal. Lo que se intenta es encontrar el compuesto, si existe, el cual es transformado el cadmio.

Muchas de las técnicas aprendidas anteriormente seguirán siendo utilizadas en el futuro. Las técnicas de limpieza así como de manejo de reactivos en el laboratorio son parte esencial de la metodología del experimento. el calculo de concentraciones, el hacer analogías entre las lecturas del electrodo y la pendiente de calibración y las observaciones cualitativas de nuestras plantas y el medio en que se encuentran durante la experimentación son practicas aprendidas que serán útiles para el desarrollo de este y cualquier otra investigación.

Proyecto con atascos

Durante el pasado mes en el laboratorio de fitoremediación se ha estado trabajando en colaboración para tratar de hallar una solución al problema del medidor de cadmio. Este no reporta medidas concisas y reales a las concentraciones reales. El proyecto ha pasado por varios procesos y etapas los cuales consistían en cambiar las soluciones y elaborar unos estándares, neutralizar el pH de la solución y cambiar los frascos de reacción a unos de plástico para evitar la pérdida de cadmio por las paredes de cristal. De todo esto nada dio frutos. Al final, se decidió darle un enfoque al electrodo en si. El electrodo es la pieza del medidor encargada de la lectura. Este estaba sucio y las soluciones en su interior estaban mezcladas. Luego de limpiar y pulir un poco la punta del electrodo para eliminar cualquier residuo que impida la lectura, el medidor dio buenos resultados. Ahora el proyecto comenzó de nuevo y como planta experimental se utilizara la rubia. Esta también es una planta tropical la cual ha pasado por los mismos procedimientos que la baquiña. Se estará experimentando con la rubia inicialmente debido a que esta es la planta con la cual mas se ha trabajado, además de ser la planta con la cual se pueden crear más repeticiones gracias al gran numero de estas en buenas condiciones.

Al fin!!!

          En el pasado mes se estuvo trabajando principalmente con la determinación de las concentraciones de cadmio en distintas soluciones y medir la efectividad, precisión y exactitud del electrodo del medidor de cadmio.  Al pasar por distintos métodos de determinación de concentración en soluciones como la de titilación la cual consiste en preparar una solución con una concentración especifica conocida y luego hacer distintas alícuotas de distintas concentraciones a partir de la misma.  Las mismas de analizan u de acuerdo a las concentraciones medidas, el medidor debe reportar unos milivoltios correspondientes a sus concentraciones.  Esto no estaba ocurriendo.  Lo que ocurría era simplemente que el electrodo tenia un poco de residuo y dado a eso las lecturas se estaban afectando.  Ya resuelto el problema, y exitosamente haber preparado y mantenido fuera de contaminación un buen stock de baquiña, se podrá proseguir con la planificación del experimento en sí.

Entre el cadmio y la baquiña

     En el transcurso de la investigación nuevos retos aparecen y con ello nuevas tareas a realizar.  Uno de ellos es la aplicación y medición del metal a medir, sea cadmio o calcio.  En este caso el cadmio es nuestro principal metal.  La aplicación del metal al medio de cultivo se hace un poco difícil ya que al añadirlo al medio cuanto este pasa por el proceso de asepsia en la autoclave el metal se pierde rediciendo así la concentración calculada considerablemente.  Otra dificultad existente lo es el equipo para la medición de concentración de cadmio.  Este no ha sido ajustado y por lo tanto esto es algo que se debe hacer.  El equipo de medición de concentraciones de cadmio funciona como un medidor de pH regular, con la excepción de que este mide iones Cd+2.  De igual manera que utilizamos sustancias amortiguadoras para el medidor de pH, el medidor de concentraciones de cadmio necesita ser equilibrado en base a unas sustancias estándar que indican el margen de error de las medidas.  Ya que estas no están disponibles en el laboratorio también es nuestra responsabilidad el prepararlas. 

       La estandarización del medidor de cadmio cuenta con una parte la cual con solo agua, I.S.A. (Ionic Strength Adjuster) y mínimas aplicaciones de cadmio en concentraciones bajas se logra una grafica la cual dada la pendiente y los valores de las concentraciones Vs. los voltímetros obtenidos en la computadora se determina la eficacia del electrodo.  Luego de realizada esta primera parte se prosigue a tomar los voltímetros reportados para las concentraciones calculadas.  El problema consiste en que los voltímetros obtenidos por el medidor no coinciden con las concentraciones estipuladas.  Una hipótesis planteada en respecto a esta situación lo era que el factor de acidez influía en la toma de las medidas.  Se repitió por una segunda vez y surgió el mismo error.  Se determino entonces crear las soluciones estándar para el ajuste del electrodo y del medidor.  Se elaboraron y midieron las soluciones estándar en otra repetición del experimento pero esto no brindo resultados.  Los planes futuros son el tomar las medidas con parte del medio utilizado para el subcultivo.  Mientras tanto, seguir la investigación esta vez mas en cuanto al equipo; su medio operativo, sus márgenes de error, su eficacia y su precisión.

A comenzar a trabajar

Después de las vacaciones, que bien sirvieron para ponernos al día con los talleres ofrecidos por mark & sloan en el cual tuve la oportunidad de aprender diversas técnicas en el área de la ingeniería genética, regresamos al laboratorio. Todo se mantuvo en un crecimiento óptimo y en el nivel de contaminación mínimo. Todas las especies tienen sus respectivos “stocks” o bancos de ejemplares. Los objetivos para este nuevo semestre fueron estipulados. Estos son: el mantenimiento de los stocks disponibles asignando cada uno a cada miembro del equipo que ahí trabaja, poder dar comienzo a la investigación en si con las especies Juana la blanca, Baquiña, Lipia e Hinojo contaminando sus medios con el metal correspondiente y analizar sus curvas de calibración y absorción de metal.

El trabajo proyectado para este semestre, en comparación con el del semestre pasado, se basa mas en el manejo, control y dominio de maquinas como lo son el HPLC , responsable de poder conocer el nivel de absorción de metales en la planta. Otros equipos con los cuales comenzamos a familiarizarnos son el disecador, columnas de cromatografía y el indicador de concentración de cadmio. Nos alejamos de el subcultivo para entrar mas en el manejo del cadmio y calcio y con el los conceptos de p.p.m. (partes por millón) se nos harán mas comunes. La estequiométrica, el análisis de graficas logarítmicas y de otras naturalezas y las técnicas asépticas como siempre serán nuestros compañeros.

Por ahora nos enfocamos en una nueva planta para nosotros, la rubia o rubia tictorum analizando su absorción de metal, esta vez con en cadmio. Comenzamos con una curva de calibración, midiendo progresivamente la concentración de cadmio a diferentes cantidades en agua. Luego hacemos lo mismo con el medio sin contaminar el cual trasladaremos especias crecidas previamente en el laboratorio. Con especies de rubia trasladadas a medio sin contaminar y medio contaminado con cadmio, analizaremos, utilizando las curvas resultantes durante dos semanas, si hubo absorción o que ocurrió con el cadmio en el medio.

Y despues de todo…

Este semestre ha sido uno incomparable en todos los sentidos con cualquier momento de mi carrera estudiantil.  La investigacion de fitoremediacion expandio mis expectativas sobre la ciencia y sus aplicaciones.  El practicarla y trabajarla nos dio a conocer su lado retante, creativo y delicado de esta practica.  Aprendimos que el ciclo de la vida siempre se cumple aunque queramos evitarlo.  Nuestro factor limitante mayor lo fueron las plagas de hongos y algunas bacterias que recibieron nuestras plantas en sus estados delicados y altamente sensibles a cualquier cambio.  Es un hecho que en donde haya vida se iniciara un ciclo, un ecosistema, un ambiente; y fue la experimentacion la que nos brindo esa vision.  Con  la practica, tecnicas asepticas y controlando la preparacion de los medios a utilizar en el subcultivo pudimos evitar que gracias a los procesos naturales, nuestros experimentos fracasaran al final.  Como metas futuras espero poder llevar mi investigacion a la siguiente fase que le corresponde, la fase de corrida de cromatografias y el analisis de las curvas de absorcion de metales.  Esta no se puede iniciar sin una ambientacion correcta de la planta a las condiciones del laboratorio, y eso ya lo logramos.

Tècnicas usadas en la investigaciòn

Para poder llevar a cabo el proyecto de fitorremediaciòn ciertas tecnicas deben dominarse y llevarse a cabo de manera excelente. Comenzando con la mas elemental pero aun asi de enorme importancia, las aseptica, cada una de las tecnicas aprendidas durante el desarrollo de la investigacion se han perfeccionando y mejorando a la vez que la experimentacion ha avanzado. Las tecnicas asepticas son a las cuales se les adjudica una prioridad mayor ya que, como previamente ha estado establecido en otros blogs sobre mi investigacion, el topico de la investigacion es sobre las plantas, sobre algo vivo lo cual es suceptible a ataques de hongos, bacterias y organismos letales para su crecimiento. Para poder trabajar las plantas en el laboratorio èstas deben pasar por un proceso de desnaturalizacion que mas bien consta en cambiar el ambiente al cual la planta se encontraba; del exterior o el suelo, a nuestro laboratorio con un medio de cultivo, pH, temperatura y luz controlados. Este proceso el cual es uno angular para nuestra investigacion, es uno muy delicado y varias tecnicas asepticas actuan sobre el. El primario lo es el autoclave o el esterilizar mediante temperaturas y presiones altas todas las herramientas y materiales a utilizarce. Ademas de autoclavar los utensilios, todos èstos son limpiados con detergente y agua destilada para asegurar su estado higienico. Otro importante lo es el lavado de la propia planta. Este lavado es uno profundo y se lleva a cabo con, ademas de agua doblemente destilada, soluciones de hipoclorito y con un componente llamado Tween 20. Al trabajar la planta debe hacerse en un “hook” o camara la cual es previamente limpiada con alcohol y luz germicida que reduce la presencia de bacterias y germenes. Este “hook” a deferencia de los destinados para trabajar con compuestos volatiles, su ventilacion es en direccion al exterior, o sea, no extrae sino que ventila. Esto es a causa de que es diseñado para protejer todo con lo cual se este trabajando y no al operador como en el otro caso.

Otra tecnica escencial en la investigacion lo es la de subcultivo y recultivo. No podriamos realizar todo lo que hemos hecho sin estas. El subcultivo consta en retirar de la planta los nodos y puntos germinales y sembrarlos en un medio. Los nodos y puntos germinales de las plantas tienen el potencial de desarrollar tejidos diferenciados como raices tallo y hojas. Esto hace posible que de una planta se puedan obtener varias. El recultivo, aunque generalmente consta de lo mismo que el subcultivo, se diferencia en que esta tecnica es utilizada luego que se halla efectuado el subcultivo. Si al subcultivar una plaga enferma a los nodos, estos se extraen del medio, se limpian en la solucion descrita anteriormente y se vuelven a subcultivar en otro medio.

Estas son en escencia las tecnicas mayormente utilizadas en las fases ejecutadas de la investigacion. En un futuro, otras tecnicas seran practicadas ya que este proyecto basicamente comienza.